الفهرس 
NORMAL LUNG HISTOLOGYOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 241 |  |  |
| | | from | 241 | | |
Abstract
Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a substantial disease burden in terms of both morbidity and mortality. And since 2019 this condition represented the leading cause of mortality in patients with severe COVID-19. Mesenchymal stem cells (MSCs) and their exosomes have shown promising results in the modulation of inflammatory responses. Exosomes, have been offering a powerful cell-free therapeutic modality, bypassing most of the safety concerns related to cell-based therapy. Lipopolysaccharide (LPS), a glycoprotein present in the cell wall of gram negative bacteria, could induce ALI in experimental animals, mimicking ARDS in humans.
Aim: Histological assessment of the potential role of exosomes derived from bone marrow MSCs in treatment of short- and long-term LPS-induced acute lung injury model in adult male albino rats.
Materials & Methods: Forty-eight adult male albino rats were used in addition to 12 young aged male albino rats that were sacrificed to harvest their bone marrow-derived MSCs and their exosomes. The adult rats were divided into 3 groups. group I (control group), group II (LPS group) included: received a single intraperitoneal injection of LPS dissolved in PBS (6mg/kg). Half of the rats were sacrificed 24 hours later (Subgroup IIA), and the other half were sacrificed 1 month later (Subgroup IIB). group III (LPS+MSC-Exos group): received LPS as in group II followed by intravenous injection of MSC-Exos (30uL/rat), one hour later. Half of the rats were sacrificed 24 hours later (Subgroup IIIA), and the other half were sacrificed 1 month later (Subgroup IIIB). Lung specimens were processed for light & electron microscopic examination, as well as morphometric and statistical analysis.
Results: H&E-stained sections of Subgroup IIA revealed marked inflammatory changes as interalveolar septa were significantly thickened by infiltrating inflammatory cells and extravasated red blood cells. Many alveoli appeared narrowed and collapsed while other areas appeared with enlarged air spaced. Blood vessels were congested with thickened walls. The lining epithelium of bronchioles appeared occasionally desquamated. Masson’s Trichrome-stained sections showed an apparent increase of collagen fibers around the bronchioles and in the interalveolar septa. Immunohistochemical stain showed a significantly increased reaction to iNOS antibodies in addition to a significantly increased Caspase-3 immune reactivity. Examination with Transmission electron microscopy showed Type I Pneumocyte having an electron dense nucleus and cytoplasmic vacuolations. Type II pneumocytes had degenerated lamellar bodies, many lysosomes and lost microvilli. Many neutrophils, macrophages, eosinophils and lymphocytes were seen infiltrating the interstitium. On the other hand, the lung structure in Subgroup IIIA showed significant improvement in all parameters. H&E-stained sections of Subgroup IIB showed focal areas where lung architecture was distorted. Some areas showed narrowed, attenuated and collapsed alveoli by the encroaching thickened interalveolar septa, other areas showed emphysematous dilated air spaces. Moderate mononuclear cellular infiltration and extravasated RBCs were noticed. The bronchiolar epithelium appeared occasionally desquamated. Blood vessels were dilated, congested with thickened walls. Masson’s Trichrome-stained sections showed an increased collagen fiber content in the interalveolar septa, around the blood vessels and the bronchiolar passages. Immunohistochemical stain showed a slight increase in iNOS immune reaction in addition to a significantly increased Caspase-3 immune reactivity. Examination with Transmission electron microscopy showed type I pneumocyte with its flattened nucleus and type II pneumocytes, with disrupted lamellar bodies and small nuclei. Some of them had microvilli on their apical surfaces and others had lost them. The interstitium was infiltrated with macrophages, eosinophils and fibroblasts. Subgroup IIIB showed significant improvement in all parameters.
Conclusion: Given the results of the current study, we concluded that LPS injection induced marked histological changes in lung structure causing acute lung injury. Administration of MSC-Exos at the time of acute lung injury had ameliorative, and therapeutic effects on the short-term and long-term pathological findings of lung injury. This study highlights the potential of using mesenchymal stem cell exosomes as a treatment for ALI in animals and as a clinical trial.
متلازمة الضائقة التنفسية الحادة هي حالة طبية تتدهور فيها حالة المريض بسرعة كبيرة وتتميز بالتهاب شديد يشمل الرئتين، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى مضاعفات أو وفاة. تظل الرعاية الداعمة هي العلاج الأساسي لـمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة، بغض النظر عن سببها. وعلى الرغم من أن العديد من الوسائل العلاجية تُقَيَّم حاليًا لعلاج المرض، إلا أنه لم يُثبَت حتى الآن أن أياً منها فعال.
تم إجراء الدراسة الحالية لتقييم الدور المحتمل على المدى القصير والطويل لإكسوزومات خلايا النسيج الأوسط الجذعية في علاج نموذج إصابة الرئة الحادة الناجمة عن متعدد السكاريد في ذكور الجرذان المهق البالغة.
في دراستنا، تم استخدام اثني عشر من الجرذان المهق، عمرها أربعة أسابيع ووزنها سبعون إلى ثمانين جرامًا، للحصول على الخلايا الجذعية من نخاع عظامها. بينما تم تقسيم ثمانية وأربعين من ذكور الجرذان البالغة التي تتراوح أوزانها بين مئتين ومئتين وخمسين جرامًا وعمرها ثمانية أسابيع إلى ثلاث مجموعات:
المجموعة الأولى (المجموعة الضابطة) (I): شملت 24 جرذًا مقسمة إلى:
المجموعة الأولى أ: 6 من الجرذان تركت دون أي تدخل، ثم تم تقسيمها إلى مجموعتين فرعيتين:
• المجموعة الأولى أ *: 3 جرذان تم التضحية بها بعد 24 ساعة من تقسيم المجموعات.
• المجموعة الأولى أ **: 3 جرذان تم التضحية بها بعد 30 يومًا من تقسيم المجموعات.
المجموعة الأولى ب: 6 من الجرذان خضعت لحقن بريتوني بمحلول الفوسفات الملحي فقط، ثم تم تقسيمها إلى مجموعتين فرعيتين:
• المجموعة الأولى ب *: 3 جرذان تم التضحية بها بعد 24 ساعة من الحقن.
• المجموعة الأولى ب **: 3 جرذان تم التضحية به بعد 30 يومًا من الحقن.
المجموعة الأولى ج: 6 من الجرذان خضعت لحقن وريدي بمحلول الفوسفات الملحي فقط، ثم تم تقسيمها إلى مجموعتين فرعيتين:
• المجموعة الأولى ج *: 3 جرذان تم التضحية بها بعد 24 ساعة من الحقن.
• المجموعة الأولى ج **: 3 جرذان تم التضحية بها بعد 30 يومًا من الحقن.
المجموعة الأولى د: 6 من الجرذان خضعت لحقن وريدي ب30 مايكرولتر من الاكسوزومات المشتقة من خلايا النسيج الأوسط الجذعية، ثم تم تقسيمها إلى مجموعتين فرعيتين:
• المجموعة الأولى د *: 3 جرذان تم التضحية بها بعد 24 ساعة من الحقن.
• المجموعة الأولى د **: 3 جرذان تم التضحية بها بعد 30 يومًا من الحقن.
المجموعة الثانية (مجموعة متعدد السكاريد الدهني): 12 من الجرذان تلقت حقن بريتوني من متعدد السكاريد الدهني المذاب في محلول الفوسفات الملحي بمقدار 6 ملجم / كجم. تم تقسيمها إلى:
• المجموعة الثانية أ (IIA): 6 جرذان، تم التضحية بها بعد 24 ساعة من الحقن البريتوني بـمتعدد السكاريد الدهني.
• المجموعة الثانية ب (IIB): 6 جرذان تم التضحية بها بعد 30 يومًا من الحقن البريتوني بـمتعدد السكاريد الدهني.
المجموعة الثالثة (مجموعة متعدد السكاريد الدهني + اكسوزومات): 12 من الجرذان تلقت حقن بريتوني من متعدد السكاريد الدهني المذاب في محلول الفوسفات الملحي بمقدار 6 مجم / كجم، ثم تم حقننها بعد ساعة ب30 مايكرولتر من الاكسوزومات المشتقة من خلايا النسيج الأوسط الجذعية في الوريد. تم تقسيمها إلى:
• المجموعة الثالثة أ (IIIA): 6 جرذان تم التضحية بها بعد 24 ساعة من الحقن بـمتعدد السكاريد الدهني.
• المجموعة الثالثة ب (IIIB): 6 جرذان تم التضحية بها بعد 30 يومًا من الحقن بـمتعدد السكاريد الدهني.
تم التضحية بالجرذان بعد التخدير باستنشاق الأثير. ثم تم تشريح الرئة بعناية وبعدها تم التخلص من جثث الحيوانات النافقة بواسطة المحرقة.
تم تمرير عينات الرئة باستخدام التقنيات الهستولوجية التالية: صبغة الهيماتوكسيلين والأيوسين وصبغة ماسون ترايكروم المعدلة لألياف الكولاجين إلى جانب الصبغة الهستوكيميائية المناعية باستخدام مضاد لل أي أن أو اس ومضاد لكاسباز-3 وأيضاً تم دراسة العينات باستخدام المجهر الإلكتروني.
بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء القياسات المورفومترية واختبارات ما بعد التحليل الإحصائي.
النتائج
أظهرت الدراسة بفحص عينات الهيماتوكسيلين والأيوسين للمجموعة IIA، أماكن بها تشوه في بنية الرئة. لوحظ وجود تسلل خلوي كبير بخلايا أحادية النواة تحيط بالشعب الهوائية الدقيقة والأوعية الدموية وتشغل الحويصلات الهوائية والحواجز بينها. كان هناك ضيق شديد بالحويصلات الهوائية وأظهرت بعض المناطق الاخرى وجود مساحات هوائية متصلة. لوحظ وجود كريات دم حمراء متسربة وإفرازات في بعض الحويصلات الأخرى. كما كانت طبقة بطانة الشعب الهوائية الدقيقة متساقطة في بعض الأماكن وزيادة في نمو الطبقة البطانية في أماكن أخرى. وأظهرت بعض الشعب الهوائية الدقيقة تسللاً خلوي أحادي النواة في داخلها. كانت معظم الأوعية الدموية محتقنة وجدرانها سميكة. وعلاوةً على ذلك، لوحظ ترسب الكريات البيضاء على جدران الأوعية. كما ظهرت تجمعات لمفاوية كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت المجموعة IIA انخفاضاً ذا دلالة إحصائية في متوسط النسبة المئوية لمساحة الحويصلات وارتفاعاً ذا دلالة إحصائية في متوسط سمك الحواجز بين الحويصلات الهوائية مقارنةً بالمجموعة الضابطة.
من ناحية أخرى، أظهرت المجموعة IIIA ، الحفاظ على الهيكل شبيه الإسفنجي للرئة. بدت معظم الحواجز بين الحويصلات الهوائية سميكةً بشكل طفيف وظهرت معظم الحويصلات بحالة سليمة، مقارنة بالمجموعة IIA. الحويصلات كانت مبطنة بالنوع الأول والثاني من الخلايا الرئوية. تم الكشف عن تسلل خلوي معتدل من الخلايا الأحادية النواة حول الأوعية الدموية وفي الحواجز بين الحويصلات الهوائية. أظهرت معظم الشعب الهوائية الدقيقة بطانة متكاملة دون تساقط وكانت الأوعية الدموية محتقنة. علاوةً على ذلك، أظهرت المجموعة IIIA زيادةً ذات دلالة إحصائية في متوسط النسبة المئوية لمساحة الحويصلات الهوائية، وانخفاضاً ذا دلالة إحصائية في متوسط سمك الحواجز بين الحويصلات الهوائية، مقارنةً بالمجموعة IIA.
فحص المجموعةIIB ، أظهر أماكن بها تشوه في بنية الرئة. بعض المناطق أظهرت حويصلات هوائية ضيقة وكانت الحواجز بين الحويصلات الهوائية سميكةً، في حين أظهرت مناطق أخرى مساحات هوائية متصلة. لوحظ تسلل خلوي معتدل من الخلايا الأحادية النواة وتسرب كريات دم حمراء تحيط بالشعب الهوائية الدقيقة والأوعية الدموية وتشغل الحواجز الموجودة بين الحويصلات الهوائية. طبقة بطانة الشعب الهوائية الدقيقة بدت متساقطة في بعض الأماكن، وأظهرت بعض الشعب الهوائية الأخرى زيادةً في نمو الطبقة البطانية والبعض الآخر أظهر طبقة عضلية ملساء متقطعة. معظم الأوعية الدموية كانت محتقنة بجدران سميكة. وتم ترسيب الهيموسيدرين البني في نسيج الرئة. لوحظ أيضاً تجمعات لمفاوية كبيرة وتسرب كريات الدم الحمراء. علاوةً على ذلك، أظهرت المجموعة IIBزيادةً ذات دلالة إحصائية في متوسط النسبة المئوية لمساحة الحويصلات الهوائية وانخفاضاً ذا دلالة إحصائية في متوسط سمك الحواجز بين الحويصلات الهوائية مقارنةً بالمجموعة الضابطة.
بينما كان هيكل الرئة في المجموعة IIIB ، مماثلاً تقريبًا للمجموعة الضابطة. معظم الحويصلات الهوائية كانت مفتوحة ومعظم الحواجز بين الحويصلات الهوائية كانت رقيقة عدا بعض الحواجز التي أظهرت زيادة طفيفة في السمك في بعض الأجزاء. الحويصلات الهوائية كانت مبطنة بالنوع الأول والثاني من الخلايا الرئوية. لوحظ تجمع خلوي طفيف من الخلايا الأحادية النواة حول الأوعية الدموية، وحول الشعب الهوائية الدقيقة، وفي الحواجز بين الحويصلات الهوائية. معظم الشعب الهوائية الدقيقة أظهرت بطانةً سليمةً منتظمةً مع تساقط أقل إلى جانب طبقة غير متقطعة من العضلات الملساء. لوحظت بقايا طفيفة من الخلايا داخل الشعب الهوائية الدقيقة. كانت الأوعية الدموية محتقنة بشكل طفيف مع جدران أقل سمكًا. تم ملاحظة موقع الحاجز بين الدم والهواء بالإضافة إلى بعض ترسيبات الهيموسيديرين في نسيج الرئة. بالتالي، لوحظ تحسن في جميع التغيرات الهستولوجية بشكل واضح عند مقارنتها بالمجموعةIIB. علاوةً على ذلك، أظهرت المجموعة IIIB زيادةً ذات دلالة إحصائية في متوسط النسبة المئوية لمساحة الحويصلات الهوائية، وانخفاضاً ذا دلالة إحصائية في سمك الحواجز بين الحويصلات الهوائية مقارنةً بالمجموعة IIB.
فحص العينات المصبوغة بماسون ترايكروم للمجموعة IIA أظهر زيادةً في محتوى ألياف الكولاجين في الحواجز بين الحويصلات الهوائية وحول الأوعية الدموية والشعب الهوائية الدقيقة، مقارنةً بالمجموعة الضابطة. أظهرت نسبة المساحة المتوسطة لألياف الكولاجين المصبوغة زيادة ذات دلالة إحصائية مقارنةً بالمجموعة الضابطة. أما المجموعة IIIA فأظهرت تراكمًا خفيفًا لألياف الكولاجين في الحواجز بين الحويصلات الهوائية، وحول الأوعية الدموية، والشعب الهوائية الدقيقة. وقد اظهر انخفاضاً ذا دلالة إحصائية مقارنةً بالمجموعة. IIA وقد انخفضت نسبة المساحة المصبوغة لألياف الكولاجين انخفاضاً ذا دلالة إحصائية مقارنةً بالمجموعة IIA. أما المجموعة IIB فأظهرت زيادة في محتوى ألياف الكولاجين في الحواجز بين الحويصلات الهوائية، وحول الأوعية الدموية، الشعب الهوائية الدقيقة، مقارنةً بالمجموعة الضابطة. واظهرت نسبة المساحة المتوسطة لألياف الكولاجين المصبوغة زيادة ذات دلالة إحصائية مقارنةً بالمجموعة الضابطة. وأما المجموعة IIIB فقد أظهرت تراكمًا ضئيلًا لألياف الكولاجين في الحواجز بين الحويصلات الهوائية، وحول الأوعية الدموية، وجدران الشعب الهوائية الدقيقة. وقد انخفضت نسبة المساحة المصبوغة لألياف الكولاجين انخفاضاً ذا دلالة إحصائية مقارنةً بالمجموعة IIB.
أظهرت الصبغة الهستوكيميائية المناعية باستخدام مضاد لل أي أن أو اس زيادة ذات دلالة إحصائية في التفاعل المناعي في المجموعة IIA مقارنةً بالمجموعة الضابطة. أما المجموعة IIIA فأظهرت انخفاضًا ذا دلالة إحصائية في التفاعل المناعي لل أي ان أو اس مقارنةً بالمجموعة IIA. وأظهرت المجموعة IIB زيادة غير مؤثرة إحصائياً في التفاعل المناعي لل أي ان أو اس مقارنةً بالمجموعة الضابطة. والمجموعة IIIB أظهرت انخفاضًا غير مؤثر إحصائياً في التفاعل المناعي لل أي ان أو اس مقارنةً بالمجموعة IIB.
أظهرت الصبغة الهستوكيميائية المناعية باستخدام مضاد للكاسباز-3 زيادة ذات دلالة إحصائية في التفاعل المناعي في المجموعة IIA مقارنةً بالمجموعة الضابطة. أما المجموعة IIIA فأظهرت انخفاضًا ذا دلالة إحصائية في التفاعل المناعي للكاسباز-3 مقارنةً بالمجموعة IIA. وأظهرت المجموعة IIB زيادة ذات دلالة إحصائية في التفاعل المناعي للكاسباز-3 مقارنةً بالمجموعة الضابطة. وأما المجموعة IIIB فأظهرت انخفاضًا ذا دلالة إحصائية في التفاعل المناعي للكاسباز-3 مقارنةً بالمجموعة IIB.
فحص المجموعة IIA بالمجهر الإلكتروني أظهر تسللًا خلويًا كبيرًا من الخلايا الأحادية النواة وتضخماً في الحواجز بين الحويصلات الهوائية وتقلصاً في مساحات الحويصلات. وكان هناك تسلل للنوتروفيلات وكذلك خلايا الماكروفاج والايزينوفيل والليمفوسايت، بالإضافة إلى الكرويات الحمراء المتسربة. وكانت خلايا النوع الأول من الخلايا الرئوية لها نواة طويلة غامقة وسيتوبلازم مفرغ. وظهرت خلايا النوع الثاني بنواة مستديرة متقلصة، وعدة جسيمات رقائقية تالفة، والعديد من الليسوزومات وكانت الشعيرات الدقيقة غائبة عن سطحها.
أظهر فحص المجموعة IIIA خلايا النوع الأول من الخلايا الرئوية بالنواة المطولة وأيضاً خلايا النوع الثاني بنواتها المستديرة ذات المواد الوراثية النشطة وجسيمات رقائقية تالفة جزئيًا وشعيرات دقيقة على سطحها. لوحظ تسلل خلايا الماكروفاج داخل الحويصلات. كما تم ملاحظة موقع الحاجز بين الدم والهواء.
أظهرت المجموعةIIB خلايا النوع الأول من الخلايا الرئوية ونواتها المسطحة. وأظهرت خلايا النوع الثاني من الخلايا الرئوية جسيمات رقائقية متمزقة ونوى صغيرة. وكانت لدى بعضها شعيرات دقيقة على سطحها والبعض الآخر لم يكن لها شعيرات. كما كان هناك تسلل لخلايا الماكروفاج والايزونوفيل. لوحظ وجود خلايا الفيبروبلاست، محاطة بألياف الكولاجين.
أظهرت المجموعة IIIB خلايا النوع الأول من الخلايا الرئوية، وكانت نواتها منتظمة ومطولة ومسطحة، وخلايا النوع الثاني كانت نواتها مستديرة، وجسيماتها الرقائقية تالفة جزئيًا وشعيراتها الدقيقة مرئية على سطحها. أظهرت خلايا البلازما والايزونوفيل والليمفوسايت والنيوتروفيل؛ بالإضافة إلى بعض ألياف الكولاجين. كما تم ملاحظة موقع الحاجز بين الدم والهواء.
الاستنتاجات
في ضوء نتائج الدراسة الحالية، يمكن الاستنتاج بأن حقن متعدد السكاريد تسبب قي تغيرات هستولوجية ملحوظة في هيكل الرئة وأدى الى إصابة رئوية حادة. كما أظهر استخدام الاكسوزومات المشتقة من خلايا النسيج الأوسط الجذعية في وقت الإصابة الحادة للرئة، تأثيرًا تحسينيًا وعلاجيًا على التأثير الخلوي للإصابة الرئوية القصيرة والطويلة المدى.