الفهرس 
IntroductionOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 225 |  |  |
| | | from | 225 | | |
Abstract
يعتبر انزيم الليبيز من الانزيمات المسئولة عن تكسير روابط الاستر الموجودة في الدهون وتحويلها الى احماض دهنية (تحلل) وله القدرة أيضا على تكوين روابط الاستر بين هذه الاحماض في وجود المذيبات العضوية (تكوين) وذلك في غياب الماء.
انزيمات الليبيز تنتج بواسطة العديد من الميكروبات التي تشمل البكتيريا، الخميرة والفطريات وغيرهم. ان هذه الانزيمات لها دور هام في مختلف الصناعات على سبيل المثال الغذاء-معالجة مياه الصرف الصحي-العقاقير الطبية مستحضرات التجميل وكذلك في انتاج الوقود الحيوي.
وتهدف الدراسة في هذه الرسالة إلى انتاج انزيم الليبيز بواسطة بعض السلالات المحلية وذلك من خلال عزل وتعريف اكفاء العزلات القادرة على تكسير الدهون باستخدام بعض المخلفات الصناعية الرخيصة كمصادر غذائية كربونية (مخلفات الزيوت والدهن) من اجل النمو وإنتاج الانزيم. وكذلك تم تحسين العوامل التي تؤثر على انتاج الليبيز مستخدمة الطرق التقليدية (كل متغير على حدة مع تثبيت باقي العوامل) وأيضا الأساليب الحديثة من خلال التداخل بين العوامل الغذائية والبيئية وبعضها البعض بتطبيق برنامج إحصائي معتمد على منهجية الاستجابة السطحية Response Surface Methodology. وركزت الدراسة على استخلاص الانزيم وتنقيته جزئيا بغرض اجراء دراسات عن حركيات الانزيم بجانب دراسة خواصه الطبيعية والكيميائية وتحميل الانزيم المنقاه جزئيا واستخدامه في بعض التطبيقات.
ويمكن تلخيص النتائج على النحو التالي:
1- تم اختيار 3 عزلات فطرية (AS11 , AS24 and R1) من بين 82 عزلة بكتيرية و فطرية حيث تم عزلهم من تربة ملوثة بالزيوت من محطة بنزين - بنها – مصر ، معتمدا علي قطر هاله تحلل الزيت في البيئة الصلبة حيث يتراوح ما بين 76-80 ملليمتر وايضا على نشاط الانزيم في البيئة السائلة و يتراوح ما بين 18,6 – 70,8 وحدة/مل. وكانت العزلات الفطرية هي المفضلة في انتاج انزيم الليبيز عن العزلات البكتيرية.
2- تم تعريف أكفاء العزلات بواسطة الخصائص المظهرية حيث وجد أن كلا العزلتين AS24 و AS11 ينتميان الى جنس Aspergillus . في حين ان العزلة R1 تنتمي لجنس Rhizopus.
3- تم حساب معايير النمو والتي تشمل معدل النمو التخصصي (μG) وزمن التضاعف (td) ومعدل التضاعف (MR) للعزلات المختارة حيث وجد أن معدل النمو التخصصي (μG) هو 0.183 و 0.077 و 0.21 في ساعة وزمن التضاعف هو 3.79 و 9 و3.3 لكل ساعة ومعدل التضاعف هو 1,67 و 0.59 و 2.20 لكـــل مــن Aspergillus sp. AS11 و Aspergillus sp. AS24 و Rhizopus sp. R1 ،على التوالي. وقد أكدت النتائج أن الثلاث عزلات حققوا أعلى نمو لوغاريتمي أثناء اليوم الأول الى اليوم الثاني من فترة التحضين.
4- وجد أن امثل فترة تحضين لنشاط الانزيم بعد أربعة أيام حيث أعطت اعلي إنتاجية 41.2 و 23.5 و91.8 وحدة/مل و بمعدل انتاج تخصصي يصل الي 0.062 و 0.061 و 0.059 في الساعة لكلا من Aspergillus sp. AS11 و Aspergillus sp. AS24 و Rhizopus sp. R1 ، على التوالي. وكذلك تم دراسة معامل الارتباط بين فترة التحضين ونشاط الانزيم حيث تراوحت بين 0,42 الى 0,58 للعزلات المختارة.
5- تم دراسة تأثير 11 مصدر كربوني على نشاط الليبيز. وأثبتت النتائج ان مخلفات زيوت قلي كلا من الأسماك واللحوم هما الأفضل. وأضيف مخلف زيت قلي الأسماك الي بيئة الإنتاج بتركيز 2% لكلا من ميكروبي Aspergillus sp. AS11 وAspergillus sp. AS24 و1% لميكروب Rhizopus sp. R1 والتي زودت نشاط الانزيم بنسبة 17.6، 0.35و8.5 % مقارنة بأفضل تركيزات لزيوت قلي اللحوم.
6- تم دراسة تأثير 13 مصدر نيتروجيني على انتاج الليبيز. واتضح أن خليط من الببتون بتركيز 1.5% مع مستخلص الخميرة بتركيز 0.5 % هو أفضل مصدر لفطر Rhizopus sp. R1 بينما كانت أوكسالات الامونيوم بتركيز1.24% هي الأمثل مع كلا من Aspergillus sp. AS11 و Aspergillus sp. AS24.
7- اختبرت مستويات مختلفة من الاس الايدروجيني في بيئة الإنتاج. واشارت النتائج أن درجة الحموضة 6 هي الأمثل لإنتاج الانزيم بواسطة Aspergillus sp. AS11 بينما درجة الحموضة 5 هي الأفضل بواسطة كلا من Aspergillus sp. AS24 و Rhizopus sp. R1.
8- استخدمت درجات مختلفة من حرارة التحضين تراوحت بين 20 – 40 درجة مئوية. وقد سجلت درجة الحرارة 30 درجة مئوية أعلى نشاط للإنزيم وكان 55.8 و35.9 و141.8 وحدة/مل بواسطة Aspergillus sp. AS11 و Aspergillus sp. AS24 و Rhizopus sp. R1، على التوالي.
9- تم اختبار تأثير مستويات مختلفة من حجم اللقاح تتراوح ما بين 1 – 10%. ووجد ان أنسب حجم لقاح كان 8% لكلا من Aspergillus sp. AS11 و Rhizopus sp. R1 بينما حجم اللقاح 6 % هو الأنسب لفطر Aspergillus sp. AS24. وكان معامل الارتباط إيجابيا بين حجم اللقاح و وزن الخلية الجاف وكذلك نشاط الانزيم حيث تراوح بين 0.91 الى 0.95 و من 0.6 الى 0.78 على التوالي.
10- تم تعريف أكفأ عزلتين (Aspergillus sp. AS11 و Rhizopus sp. R1) بناءا على الخصائص الجينية باستخدام التتابع النيكلوتيدي الريبوسومي (18S rRNA) على أنهما Aspergillus niger و Rhizopus oryzae ، على التوالي.
11- تم تقييم التداخل بين عشرة متغيرات تتضمن خمسة عوامل غذائية (تركيزات كلا من مخلف زيت قلي الأسماك والببتون ومستخلص الخميرة وملحي الفوسفات K2HPO4 وKH2PO4) بالإضافة الي خمسة عوامل بيئية (الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة وحجم اللقاح وفترة التحصين وسرعة الرج) في تأثيرها على انتاج الليبيز بواسطة فطر R. oryzae R1 باستخدام تصميم التجارب الإحصائي Plackett-Burman Design (PBD). وقد قيمت نفس العوامل السابقة للفطر A. niger AS11 باستثناء مصادر النيتروجين حيث استبدل خليط الببتون ومستخلص الخميرة بـأوكسالات الأمونيوم. وأوضحت النتائج أن أكثر المتغيرات تأثيرا على نشاط الإنـزيـم هي 4 متغيرات وهم سرعــة الــرج وفترة التحـصـين وحـجـم اللقـاح ودرجـة الحـرارة بواسطــة R. oryzae R1 و3 متغيرات هم سرعــة الــرج وفترة التحـصـين ودرجـة الحـرارة بواسطــة A. niger AS11.
12- تم اختيار هذه العوامل لتحسين انتاج الليبيز باستخدام منهجية الاستجابة السطحية Response Surface Methodology (RSM) معتمدا على تصميم النقطة المركزية (CCD)Central Composite Design . بالنسبة لفطر R. oryzae R1 اعطي أعلى نشاط للإنزيم (216.2 وحدة/مل) عندما تم استخدام 8 % من حجم لقاح عند درجة حرارة 28م وسرعة رج 150 دورة/دقيقة بعد أربعة أيام من التحضين. أما فطر A. niger AS11 فقد سجل أعلى نشاط للإنزيم (68.8 وحدة/مل) عند درجة حرارة 25م وسرعة رج 150 دورة/دقيقة بعد خمسة أيام من التحضين.
13- أجريت تجارب للتحقق من دقة البرنامج. وقد أوضحت النتائج ان القيمة المتوقعة لنشاط الانزيم هي 221.58 ,68.85وحدة/مل الناتجة بواسطة و Rhizopus sp. R1 Aspergillus sp. AS11, على التوالي بما يتفق مع القيم العملية 218.5و66.15 وحدة/مل. وهذا أكد دقة النموذج الإحصائي في قدرته على توقع نشاط الانزيم.
14- تم تنقية الإنزيم جزئيا الناتج بواسطة فطر R. oryzae R1 بالتشبع بتركيزات متدرجة من صفر إلى 80% من كبريتات الأمونيوم. ووجد أن تركيز 20-40% متبوع بالفصل الغشائي (Dialysis) هو أفضل تركيز حيث اعطى اعلى تخصصية للأنزيم (1.56 وحدة/مجم) والتي حسنت تنقيته الإنزيم بحوالي 1.1 مرة بما يعادل نسبة استخلاص 87.5%.
15- توصيف الليبيز المنقى جزئيا والناتج من فطر R. oryzae R1.
• تم دراسة التخصصية الوضعية للإنزيم المنقى بواسطة Thin Layer chromatography وقد أوضحت النتائج ان الإنزيم الناتج بواسطة Rhizopus sp. R1 تم تصنيفه بأنه غير متخصص.
• دراسة تأثير أحجام مختلفة من الزيت (كمادة تفاعل) من 0.5 إلى 3.5 مل وقد وجد أن حجم 2 مل هو أفضل لنشاط الإنزيم حيث سجل اعلى نشاط للإنزيم 195.6 وحدة/مل بما يعادل 108% للنشاط النسبي بالنسبة (2.5 مللي من الزيت).
• تم حساب حركيات الإنزيم من خلال السرعة القصوى (Vmax) وثابت ميكالس (Km) بواسطة معادلة Michaelis-Mentent ومشتقاتها معادلة Eadie-Hofstee ومعادلة Lineweaver-Burk حيث كانت قيمة Km = 0.3 مجم/مل بينما قيم Vmax = 208,3 و 204 وحدة/مل لكل من معادلة Lineweaver-Burk و Eadie-Hofstee ، على التوالي.
• كان أعلى نشاط للإنزيم (102.6% نشاط نسبي) عند رقم هيدروجيني 6 بثبات لمدة 30 دقيقة وقد أدت زيادة الوقت الى نقص نشاط الانزيم.
• أفضل نشاط نسبي (104.5%) لإنزيم الليبيز تحقق عند درجة حرارة 40م وبعد ثبات لمدة 30 دقيقة أصبح النشاط النسبي 100,8%. كانت قيم معامل درجة الحرارة (Q10) لنشاط الليبيز الناتج بواسطة فطر R. oryzae R1 هي 1,34 و 1,19 بين 20-30م و 30-40م على التوالي.